온도가 미생물 생장에 미치는 영향

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온도가 미생물 생장에 미치는 영향

자연인206 2014. 7. 8. 14:24

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exp5. 탁도측정법 & 온도가 미생물 생장에 미치는 영향 & 미생물 보존법

1. Instruction

1) 탁도측정법

- 조사해야할 표본의 수가 많은 경우 또는 세균의 생장률 등을 조사하고자 할 때 배양액의 흡광도를 측정하는 방법

- 세균의 배양액에 일정한 파장의 빛을 통과시켰을 때 용액은 그 빛을 흡수함

- 이 때, 흡수된 빛의 양이 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 방법

- 세균의 수(농도)가 증가함에 따라 흡광도는 비례하여 증가

- 반대로 투과된 빛의 양은 시료 속의 세균의 수에 반비례

2) 미생물 생장 곡선

- 지체기

: 세포의 수가 증가하지 않는 초기

: ATP, 필수적인 보조인자, 리보좀 등이 부족하기 때문에 합성하는 시기

: 새로운 배지에 다른 영양물질을 사용하는데 필요한 새로운 효소를 합성

- 대수기

: 배지의 조성 및 생장 조건 아래에서 분열할 수 있는 최고의 속도로 분열

: 생장속도는 일정하게 나타나서 일정한 간격으로 숫자가 2배로 증가

: 모든 세포가 동시에 분열하지 않기 때문에 생장곡선은 부드러운 곡선 증가

- 정체기

: 미생물의 총 세균의 수는 일정

: 세포의 분열과 세포의 사멸이 평형을 이룰 때 나타남

: 집단의 세포가 대사적인 활성을 유지한 채로 단순히 분열을 멈추는 경우

- 사멸기

: 독성 노폐물의 축적과 불리한 환경의 변화가 일어나는 시기

: 대수기와 마찬가지로 매시간 일정한 부분이 사멸함

3) 온도가 미생물 생장에 미치는 영향

- 미생물의 생장에서 중요한 요소 중 하나가 적합한 온도

- 이러한 온도를 최적온도(Optimal Temperature)라고 함

- 온도를 최적온도 이하로 낮게 하거나 높게 하면 미생물의 생장률이 감소

- 최고온도와 최적온도는 생물체에 포함된 효소에 의해 결정되며 이 온도는 크게 저온균, 중온균, 고온균으로 구분

① 저온성 세균

: 최적 생장온도는 10~15℃, 생장 온도범위가 0~25℃인 세균

: 냉장조건에서 분리되며, 냉장식품의 부패는 저온성 세균으로 인한 것임

② 중온성 세균

: 최적 생장온도는 25~40℃, 생장 온도범위가 10~50℃인 세균

: 대다수의 세균은 중온성 세균임

③ 고온성 세균

: 최적 생장온도는 50℃이상이며, 생장 온도범위는 40~80℃인 세균

: 고온성 세균은 90℃ 온천에서도 생존할 수 있음

4) 미생물 보존법

- 균주(세균)을 어떤 연구 목적에 이용하기 위하여 생리활성을 유지하면서 필요한 기간, 대부분은 반영구적으로 보존하는 것

- 미생물 보존 시 주의할 점

: 보존중에 사멸이나 변이를 방지

: 보존기간을 길게 유지

: 오염이 일어나지 않게해야 함

: 조작이나 필요한 장치 등이 가능한 한 간단

: 대부분 냉장 보관

- 미생물 보존법

사면배지법 (Slant culture)	- 코오지한천, 맥아즙한천배지 : 효모, 곰팡이 - 육즙한천배지 : 세균의 보존 - 곰팡이와 세균은 6개월, 효모는 3~6개월 보존가능 - 2~4℃에서 보존
천자배지법 (Stab culture)	- 젖산균 등의 혐기성 세균보존에 이용
당액증보존법 (Preservation in sugars)	- 효모보존에 사용하는 일반적 방법 - Hansen 병에 살균한 10% 설탕액을 넣고 여기에 새로 배양한 소량의 효모를 가하여 냉암소에서 보존
모래배지법 (Sand culture)	- 건조상태에서 오래 견딜 수 있는 세균 또는 곰팡이의 보존에 사용 - 바다모래를 산, 알칼리 및 물로 여러번 씻어 시험관 깊이 2~3cm정도 넣고 건열살균 - 여기에 3~4일 간 배양한 균체를 약 1ml정도 첨가하여 모래와 잘 혼합시켜 진공중에서 건조시킨 후 시험관을 밀봉하여 보존하는 것 - 수년간 보존 가능
토양증보존법 (Preservation in soil)	- 세균, 곰팡이 및 효모에 이용가능 - 장기보존가능 - 건조한 토양에 물을 가하고 수분의 약 25%가 되도록 시험관에 분주하여 121℃에서 3시간 살균하고 2~3일 후에 다시 한 번 살균한 후 포자나 균사현탁액을 가하여 실온에서 보존
유증보존법 (Preservation in oil)	- 곰팡이 보존에 사용 - 고체배지에 배양한 후 균체 위에다 살균한 광유를 1cm 두께로 부은 후 보존 - 배지의 건조를 막아 3~4년 보존가능 - 냉장 보관
동결건조 보존법 ( Methods of storing cultures by freeze-drying)	- 동결처리한 세포부유액을 진공저온에서 건조시켜 용기의 앰플을 융봉하여 저온에서 보존 - 세균, 바이러스, 효모, 일부의 곰팡이, 방선균 등의 포자를 장기보존 - 세포의 분산매로 탈지유, 혈청 등을 사용
L-건조법 (L-drying preservation)	- 동결건조법에서 발생되는 동결에 의한 장애를 받기 쉬운 세균의 보존에 많이 이용 - 농후한 세포부유액을 앰플에 넣어 진공펌프를 사용하여 감압, 저온에서 건조시켜 진공상태에서 앰플을 융봉하여 보존 - 동결건조의 변법
동결보존법 (Deep Freezing Methods)	- 곰팡이, 효모 및 세균의 장기보존에 이용 - 동해예방제로 디메틸 황산화물(DMSO), 글리세린 등을 넣어 보존 - -70℃에서 보관

- 동결보존법의 장점

: 보존에 사용된 포자가 직접 발아하기 때문에 형태상 또는 생리적 변이가 거의 없고 장기간 보존이 가능

: 잡균의 오염이 거의 없고 저장이 간편

2. Materials

- Salmonella 액체 배양체(Overnight culture 24시간 배양), PBS, Lactose broth medium, Spectrophotometer, Cell

- Salmonella 액체 배양체(Overnight culture 24시간 배양), Loop, 냉장고, Incubator(37℃)

- 균주, Glycerol, 1.5ml tube, 파이펫, tip, ice, deepfreezer

3. Methods

1) 온도가 세균의 성장에 미치는 영향

① 각 세균을 Lactose agar media에 0.1ml씩 2개 접종한다.

② 각각의 배지를 4℃, 37℃에 배양한다.

③ Overnight 시킨 후에 관찰하여 배양 정도를 확인한다. (Colony 수의 확인)

* Lactose agar media (g/L)의 조성

- Beef extract : 3g

- Peptone : 5g

- lactose : 5g

- Agar : 15g (1.5%)

2) 균의 보존 방법

① Glycerol 30g에 증류수를 20ml 넣고 Final 50ml이 되게 하여 60% Glycerol을 만든다.

② 60% Glycerol을 Autoclave에 10분 멸균한다.

③ 60% Glycerol을 15ml tube에 분주하여 오염에 주의하여 사용한다.

④ 1.5ml tube에 60% Glycerol을 미리 500㎕를 분주한다.

⑤ 보존하고자 하는 세균을 500㎕를 ④번 tube에 넣어준다.

⑥ tube를 신속하게 Ice에 옮긴다.

⑦ -70℃ deepfreezer에 보존한다.

3) SolGent Plasmid Mini-Prep Kit using a microcentrifuge 이용

Protocols

: 키트 사용전 80% (v/v) Ethanol 준비

: 80% ethanol은 WB bottle에 담아서 사용

: RNase A powder를 Buffer SP1에 첨가하여 섞어준 후 사용, 4℃에 보관

① Cell Harvest and Suspension

: 미생물 배양액 1~3ml을 2분간 원심분리하여 cell pellet을 얻는다. (1ml 2개)

: 250㎕의 Buffer SP 1 (containing RNase A)으로 cell pellet을 현탁시킨다. → 가라앉은 염 사용

② Cell Lysis and Neutralization

: 250㎕의 Buffer SP 2를 넣고 tube의 뚜껑을 닫고 10회정도 위 아래로 돌려서 부드럽게 섞어준다.

이 때, vortex 등으로 심하게 흔들어서 섞으면 안됨.

: 350㎕의 Buffer SGP 3를 넣고 위아래로 4~6회 돌려서 부드럽게 섞어준다.

: 상온에서 10분간 원심분리 (13,000rpm) → 상층액 사용

③ Column Loading

: Spin column을 2-ml collection tube(키트에 포함)에 장착시킨다.

: Step 2의 원심분리로 얻어진 상층액 (supernatants)을 장착된 Spin column으로 옮긴다.

: 10,000rpm으로 약 30초간 원심분리

: 아래 collection tube로 내려간 용액은 버리고 Spin column을 다시 장착한다.

이 때, DNA는 spin column의 membrane에 결합하여 있게 된다.

④ primary Washing (Optional)

: Spin column에 500㎕의 Buffer WB (80% Ethanol)를 넣고 원심분리 (12,000 rpm, 30초)

: Collection tube로 내려간 용액은 버리고 Spin column은 다시 장착한다.

⑤ Secondary Washing

: 750㎕의 Buffer WB (80% Ethanol)를 Spin column에 넣고 원심분리를 수행한다. (12,000 rpm, 30초)

: Collection tube로 내려간 용액은 버리고 2분간 원심분리 (12,000 rpm)를 다시 한 번 한다.

이 과정을 거쳐야 남은 Buffer WB가 완전히 제거된다.

⑥ Elution

: Spin Column을 깨끗한 1.5ml microtube (not provided)에 옮겨서 장착시킨다.

: 30~50㎕의 Buffer EB 또는 멸균된 증류수를 Spin Column의 membrane 중앙에 바로 떨어뜨린다.

: 상온에서 1분간 놓아둔 후에 원심분리 (12,000 rpm, 1분)하여 정제된 DNA solution을 얻는다.

4. Discussion

1) Spectrophotometer (분광광도계)

: 광원에서의 빛을 모노크로미터에 의해 단색화하여 시료 용액에 투과시켜 투과광의 강도를 전기신호로 변환시켜 시료의 흡광도를 측정하는 장치

색채 측정을 위해 최소 380~780nm 영역의 빛을 측정하도록 설계되며 분광광도계는 광원, 시료 측정의 관측 조건을 결정하는 광학장치,

빛을 분광시키는 분광장치, 빛을 분석하기 쉬운 신호로 변환시키는 광 검출기와 신호 처리 장치로 구성됨.

2) 온도 범위에 따른 미생물의 생장

: 미생물의 생장에 대한 온도 범위는 세 가지의 기본 생장온도로 나타냄

- 최저 온도 : 미생물의 계속적인 생장과 물질 대사를 허용하는 가장 낮은 온도로 이 온도 이하에서는 미생물의 활성이 저해됨

- 최고 온도 : 생장과 물질대사가 진행될 수 있는 가장 노은 온도로 온도가 최고치 이상으로 약간만 올라가도 생장은 멈춤

- 최적 온도 : 최저 온도와 최고 온도 사이의 중간에 위치하는 작은 온도 범위를 나타내며 가장 빠른 속도의 생장과 물질대사를 가져오게 함

Psychrophile (호냉성 생물)	15℃ 이하의 최적 온도를 가지면서 0℃에서 생장
Mesophile (호중온성 생물)	미생물의 대부분이 잘 자라는 온도. 최적 생장온도는 20~40℃의 범위 안에 포함됨
Thermophile (호열성 생물)	45℃ 이상의 온도에서 가장 잘 자람. 일반적으로 45~80℃까지의 생장온도 범위
Hyperthermophile (극호열성 생물)	80~250℃ 사이까지의 범위 (현재 효소나 세포구조가 견딜 수 있는 온도의 한계로 생각됨)