강화 사자발약쑥 효소 발효액 만들기

약성좋기로 유명한 강화사자발 약쑥으로 발효액을 만들어 보았습니다.

 

 

친환경으로 재배된 약쑥이니만큼 그냥 사용해도 좋겠지만 지상부 전체를 절단한것이서 작업과정중에 붙어있을수있는 불순물을 제거하기위해 물에 살짝 헹구어주었습니다.

하단부에는 햇볕을 보지못해 시든잎들이 붙어있었지만 그 역시 약성을 가진 잎이기때문에 제거하지않고 그대로 사용하였습니다.

 

 

세척을 하다보니 달팽이가 여기저기서 나와 수영을 ㅎㅎㅎ

친환경으로 관리되었다는 반증임으로 반갑게 물에서 회수하여 창밖 정원으로 휙~

 

 

재료세척을 하면서 나온 불순물(잡초,달팽이 ㅎㅎㅎ)들입니다.

 

 

생재라도 약쑥은 대가 거칠기때문에 이렇게 작두를 이용하면 아주 편리합니다. 약초작두는 인터넷 쇼핑몰에서 아주 저렴한 가력에 판매하고 있는데 발효재료 절단용으로는 불편이 없답니다.

 

 

자료에 따르면 사자발약쑥은 수분함량이 약 76%라고 하는데 막상 발효를 시켜보면 다른재료와 달리 수액이 아주 적게(재료 10kg당 약 2~3리트) 나오기때문에 안전하게 발효시키려면 설탕물을 만들어 부어주는것이 좋다고 봅니다.

그래서 저는 설탕을 처음에는 재료의 60%만 넣고 하룻밤 풀을 죽인 다음 재료의 20%의 설탕을 동량의 물에 타서 보충해주기로 했습니다. 

그러면 설탕은 재료무게 대비로  60% + 20% 이니까 총 80%를 넣고 발효를 시키려는것이지요 ^^  

 

 

손질해서 준비해놓은 재료와 저울로 계량해놓은 설탕~

 

 

약성이 좋은 재료이니만큼 특별히 황충길옹기에다가 ㅎㅎㅎ 옮겨담아놓고 1차 발효를 시키기로 했습니다.

 

 

하룻밤 풀을 죽인 상태의 약쑥 항아리~

 

 

설탕물을 만들어 부어주기위해서 물과 설탕을 1:1로 준비해보았습니다.

 

 

깔대기로 설탕을 생수병에 넣어주고 마개를 닫은 후 막 흔들어주면 ㅎㅎㅎ 설탕이 아주 잘 녹지요. ^&^

 

 

완성된 설탕물입니다. 이렇게 제조해서 넣어주고 모질라면 같은 방법으로 만들어 보충해주면 되겠지요~

 

 

만들어진 설탕물을 1차 발효용기에 부어주고 손으로 휘휘저어서 기존에 남아있던 설탕도 모두 녹여줍니다.

 

 

설탕물을 보충해서 재료가 자박하게 잠기는 상태가 되게해놓고 약 한달간은 수시로 휘저어 주어야만 부패하지않고 품질좋은 발효액을 얻을수있을것입니다.

 

[강화 사자발 약쑥 실험 자료]   서 론   쑥 (Artemisia sp.)은 우리나라에 자생하고 있는 국화과 다년생 식물이며 예로부터 중요한 약용식물로 널리 사용되어 왔고 특히, 만성위장병, 하복부통, 천식, 구충 및 악취제거에 효과가 있다고 알려져 왔다1-3). 쑥은 독특한 향과 맛을 지니고 있어 여러 형태의 식품으로 이용되어 왔으며4), 최근 들어 쑥의 고유한 생리활성을 이용하여 식품에 응용하고자하는 연구가 활발히 진행되어 왔다. 쑥의 일반성분은 수분 76%, 단백질 4.7%, 지방 1.9%, 조섬유 14.5%이고 특수 성분으로는 알칼로이드, 비타민, 무기질 등이 있으며 특히 필수지방산, 섬유소, 회분량이 많아 체중조절식품으로 유익하다고 보고되었다5). 인진쑥 (A. iwayomogi)은 생리활성물질로서 scoparone, capillarisn, cirsimartin, rhamnocitrin, flavonoid 등이, 산쑥 (A. montana)은 caffeic acid, catechol, protocatechunic acid 등의 항산화 성분이 보고되었다6). 쑥 (A. capoillaris)의 수용성 추출물이 항종양효과를 나타내고 개똥쑥 (A. annua)의 flavonoid 성분은 항말라리아 효과를 나타낸다고 보고되었다7). 쑥 (A. berba-alba)추출물은 혈당량을 저하시키며 체중감소를 막고 혈중지질을 저하시키는 효과를 얻으며8), 쑥 (A. pallens)의 메탄올 추출물은 고지혈증과 당뇨를 개선시킨다고 보고되었다9). 쑥추출물은 고혈압 유발인자인 angiotensin 전환 효소의 작용을 저해시키고 자유 라디칼에 전자를 공여하여 지질의 산화를 억제하며 polyphenol oxidase의 작용을 저해, 갈변을 억제하고 아질산염 소거에 효과적이라고 보고되었다10). 인진쑥(A. iwayomogi)과 물쑥의 알코올 추출물은 aspartate aminotransferase (AST, GOT), alanine aminotransferase (ALT, GPT)의 활성을 감소시켜 간 기능 보호 효과가 있으며 인진쑥의 알코올 추출물은 catalase와 superoxide dismutase (SOD) 등과 같은 항산화 효소들의 활성을 증가시켜 hydroperoxide와 O2를 효과적으로 제거, 세포 손상을 막아주는 한편, 혈청의 tocopherol 함량을 증가시켜 자유 라디칼에 의한 손상을 방지하여 발암 위험성을 감소시킨다고 보고되었다6,11). 쑥 (A. asiatica Nakai)의 에탄올 추출물 또한 사염화탄소에 의해 생성된 유리기를 감소시키고 과산화물의 분해산물이 malondialdehyde (MDA)를 증가시켜 간 손상을 방지한다고 보고되었다12). 황해쑥의 열수 및 메탄올 추출물은 백혈병계 세포주인 H9 (ATCC HTB176)세포에 대한 세포 독성과 CuZnSOD와 MnSOD 활성을 증가시킨다고 보고되었다13). 강화도는 해양성 기후로 공기가 메마르지 않고 다른 지역에 비해 여름에는 기온이 1℃ 정도 낮고, 겨울에는 큰 추위가 없으며 염기가 섞인 해풍과 해무 그리고 일조량이 많아 쑥의 품질이 양호하고, 강화 사자발쑥의 정유성분은 α, γ-terpene, borneol 등을, 황해쑥의 정유성분은 thujone, cineole, limonen 등을 함유하였으며, 정유의 양은 사자발쑥 0.5-1.4%, 황해쑥 0.4-1.2%, 인진쑥 0.3-0.5%로 보고되었다12). 사자발쑥의 정유성분은 치아우식균인 Streptococcus mutans에 대한 항균활성을 나타내며 알코올 추출물로 플라보노이드 화합물인 eupatilin을 분리, 항궤양의 지표로 이용한다고 보고되었다14). 사자발쑥 (A. princeps) 에탄올추출물중 coumaric acid는 세균증식의 억제효과가 있으며15) 쑥 (A. berba-alba) 물추출물 역시 항균활성을 나타낸다고 보고되었다16). 또한 쑥 (A. giraldii)의 flavone과 참쑥 (A. lavandulaefolia) 정유성분도 세균과 진균에 대해 증식억제효과를 나타냈으며 쑥 (A. asiatica)의 thujone, caryophyllene, farnesol 성분 또한 항균효과를 나타낸다고 보고되었다12).   본 연구에서는 강화의 사자발쑥 (A. princeps)과 황해쑥 (A. argyi)의 생리활성 성분을 살펴보기 위하여 사염화탄소 (CCl4)처리로 간손상된 실험동물 혈청의 간기능지표 효소인 aspartate aminotransferase (AST, GOT), alanine aminotransferase (ALT, GPT), 그리고 alkaline phosphatase (ALP) 활성과 페놀성 화합물, 플라보노이드 등 항산화 성분을 측정하고 또한 휘발성 향기 성분을 비교분석하고자 하였다.   >재료 및 방법     1. 재료 및 시약 본 실험에서 사용한 사자발쑥 (A. princeps)과 황해쑥 (A. argyi)은 강화농업기술센터에서 보급한 제품으로 인천의 보성사에서 구입하여 사용하였다. 위 제품들은 통풍이 잘되는 그늘에서 건조시킨 후 향기성분이 휘발되지 않도록 밀봉하여 저온에서 보관, 휘발성성분 분석 시료로 사용하였다. Ethanol, dimethyl sulfoxide (DMSO). Na2CO3, Folin-Denis, chlorgenic acid, methanol, diethylene glycol, NaOH, naringin, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA)로부터 구입하였으며 나머지 시약들은 시판 특급 시약을 사용하였다.   2. 실험동물 평균체중이 200 g인 흰쥐를 한국식품개발연구원 동물사육실에서 구입하여 난괴법에 의해서 8마리씩 4군으로 나누어 metabolic cage에 한 마리씩 넣어 분군하여 5주간 실험사육하였다. 사육실의 온도는 20℃, 습도는 50%, 채광은 12시간 명암조명을 유지하였다.   3. 식이 조성 및 실험군 식이조성 및 실험군은 기본사료에 물만 섭취시킨 정상식이군 (A), 간손상유발을 위해 사염화탄소 (CCl4) (0.2 ㎖ CCl4/체중100 g, CCl4:올리브유 = 1:3)를 함유한 식이를 섭취시킨 CCl4 투여군 (B), 기본사료와 CCl4, 사자발쑥분말 (5 g/사료 100 g)을 섭취시킨 혼합병행군 (C), 그리고 기본사료와 CCl4, 황해쑥분말 (5 g/사료 100 g)을 섭취시킨 혼합병행군 (D)으로 분류하였다.   4. 실험동물의 처리 실험사육 5주간의 최종일에 7시간 절식시킨 후 에테르마취하에 심장채혈법으로 채혈하였으며 혈액을 3,000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 얻은 혈청을 취하여 실험에 사용하였다.   5. Aminotransferase의 활성 측정 Aspartate aminotransferase (AST, GOT)활성도는 aspartate, α-ketobutyrate 기질이 효소작용에 의하여 아미노기가 전이되어 oxaloacetate와 glutamate가 생성되는 원리에 의해 혈청자동분석장치 (ADVIA 1650, Bayer Inc., Japan)으로 340 nm에서 측정하였다. Alanine aminotransferase (ALT, GPT)활성도는 alanine, α-ketobutyrate 기질이 효소작용에 의하여 아미노기가 전이되어 pyruvate와 glutamate가 생성되는 원리에 의해 혈청자동분석장치 (ADVIA 1650, Bayer Inc., Japan)으로 340 nm에서 측정하였다.   6. Alkaline phosphatase의 활성 측정 Alkaline phosphatase (ALP)활성도는 알칼리조건에서 p-nitriphenyl phosphate 기질을 효소작용에 의하여 가수분해되어 p-nitrophenol을 생성하는 원리에 의해 혈청자동분석장치 (ADVIA 1650, Bayer Inc., Japan)으로 400 nm에서 측정하였다.   7. 페놀성 화합물 정량 건조된 쑥의 전초 10 g을 세절한 후 80% 에탄올 200 ㎖에 24시간 안 침지시킨 후 여과하여 추출하였다. 에탄올추출액을 감압하에 용매를 제거하고 g/㎖ 농도로 농축시켜 항산화연구에 시료로 이용하였다. 페놀화합물의 정량은 AOAC의 Folin-Denis법을 일부 변형하여 비색정량하였다17). 쑥추출물의 건조시료 일정량을 DMSO에 녹이고 일정농도로 희석하여 각종 분석에 이용하였다. 시료 0.2 ㎖에 Na2CO3을 2.0 ㎖ 가하고 2분간 실온에 방치한 후 50% Folin-Denis 시약을 0.2 ㎖ 가하고 혼합하여 실온에서 30분 정치한 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Chlogenic acid의 농도를 달리하여 조제한 후 표준 곡선을 작성하고 모든 처리는 3회 반복하여 측정하였다.   8. 플라보노이드 정량 쑥추출물을 동결건조한 분말 1 g에 50% 메탄올 용액 60 ㎖를 가하여 80℃에서 1시간동안 환류추출후 냉각한 다음 50% 메탄올를 가하여 시료용액으로 사용하였다. 시험관에 시료용액 1 ㎖와 diethylene glycol 10 ㎖, 1 N NaOH 1 ㎖를 가한 후 37℃에서 1시간 동안 방치시킨 다음 420 nm에서 흡광도를 측정하여 naringin으로 환산하였다18).   9. DPPH 자유 라디칼 소거법에 의한 항산화활성 쑥추출물의 DPPH에 대한 전자 공여능을 측정하였다18). 각 추출물은 DMSO에 1 ㎎/㎖의 농도가 되도록 녹여 사용하였다. 각 추출물 0.5 ㎖에 DPPH 시약 3 ㎖를 가하고 잘 섞은 후 실온에서 30분 동안 방치후 517 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조군으로는 시료 대신 DMSO를 넣어 측정하였다. 전자공여효과는 시료첨가군과 첨가하지 않은 군의 흡광도를 사용하여 백분율을 나타내었다.   10. 휘발성 향기성분 분석 건조된 쑥을 SMPE (solid phase microextraction) 방법으로 포집하였다. SMPE 방법은 흡착용 fiber로 PDMS (polydimethylsyloxane, 100 μm, Supelco Inc., USA) fiber를 사용하였으며 시료 2 g을 10 ㎖ glass vial에 넣고 aluminum crimp seal로 밀봉한 후 실온을 유지하면서 headspace gas를 PDMS fiber로 포집하였다. 포집된 향기성분은 Varian chrompack 8200 autosampler (Varian Inc., USA)를 이용하여 자동적으로 주입하여 분석하였다. 휘발성 성분은 Varian Saturn 2000R (Varian Inc., USA)을 사용하여 분석하였다. GC/MS (gas chromatograph-mass spectrometer) 분석조건으로 column은 DB WAX (60 m x 0.25 mm x 0.25 mm)를 사용하였고 온도는 70℃에서 2분간 유지한 후 230℃까지 3℃/min의 속도로 승온하였고 230℃에서 5분간 유지하였다. Injector의 온도는 180℃, 운반기체는 helium (He), 유속은 1.4 ㎖/min으로 하였다. 각 성분의 mass spectrum은 표준 mass spectrum과 비교하고 표준품과 GC retention time (RT)을 비교하여 성분을 확인하였다.   >결과 및 고찰   1. Aminotransferase 및 alkaline phosphatase의 활성 흰쥐에 사자발쑥 (A. princeps)과 황해쑥 (A. argyi)분말 (5 g/사료 100 g) 및 CCl4 (0.2 ㎖/체중 100 g)을 5주간 투여후 혈청의 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), 그리고 alkaline phosphatase (ALP) 활성의 변화를 Fig. 1-3에 나타내었다. Fig. 1-3에 나타난 것처럼 정상식이군 (A)에 비하여 CCl4 투여군 (B)은 AST, ALT 그리고 ALP 활성을 현저하게 증가시켰다. 간장애지표가 되는 AST, ALT 및 ALP 활성의 증가는 간세포손상과 연관성이 있는 것으로 각종 간질환, 심근경색, 지방간, 황달, 용혈 등에 의해 혈중으로 방출되어 항진되어 나타난다고 보고되었다19). CCl4 투여에 의한 혈청중 AST, ALT 및 ALP 활성의 증가는 CCl4에 의한 간세포 손상이 증대되어 나타난 것으로 사료된다. CCl4와 사자발쑥 혼합병행군 (C)은 AST, ALT 및 ALP를 각각 33, 23 및 19% 감소시켰으며 CCl4와 황해쑥 혼합병행군 (D)도 역시 각각 37, 33 및 26% 감소시켰다. 이상의 결과에서 간조직의 손상지표로 알려진 AST, ALT 및 ALP 활성이 CCl4 단독투여군 (B)에 비해 사자발쑥과 황해쑥 혼합병행군 (C, D)이 유의성있게 감소된 것으로 보아 사자발쑥과 황해쑥이 간조직손상에 대해 보호작용이 있는 것으로 사료된다.   2. 항산화 성분 페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포하며, 특히 2차 대사산물로 다양한 구조와 생리활성을 나타낸다. 특히 이 페놀성 화합물들은 생체 내에서 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려지면서 천연물로부터 항산화 물질을 추출하려는 연구가 최근 활발하게 일어나고 있다. 본 연구에서는 식물체에 다량 함유되어 있는 chlorogenic acid를 표준 곡선으로 이용하여 강화의 사자발쑥과 황해쑥을 에탄올로 최종농도가 g/㎖ 농도로 농축한 후 추출한 각 추출물의 총페놀함량을 측정하였다. 총페놀함량은 사자발쑥 10.2 ㎎/㎖, 황해쑥 4.7 ㎎/㎖로 나타나 사자발쑥의 총페놀함량이 가장 많았다 (Fig. 4). 산쑥 (A. montana pampan)의 페놀산 추출물을 대두에 첨가한 결과 높은 항산화능을 나타내며 이러한 페놀산은 catechol, vanillin, umbellinferone, protocatechunic acid, ferulic acid, caffeic acid로 알려져 있다5). 인진쑥의 에탄올 추출물은 항산화성이 크며 인진쑥의 생리활성 성분으로 scoparone, capilartemisin, capaillarisin 등이 있다고 보고되었다20). 쑥의 에탄올추출물을 감압농축기로 이용하여 g/㎖ 농도로 농축한 후 naringin을 표준 곡선으로 이용하여 사자발쑥과 황해쑥의 플라보노이드 함량을 측정한 결과 사자발쑥 6.1 ㎎%과 황해쑥 3.6 ㎎%로 나타나 사자발쑥의 플라보노이드 함량이 가장 많았다 (Fig. 4). 일반적으로 쑥은 다양한 플라보노이드를 함유하고 있으며 6-methoxy flavonoid의 공통적인 구조를 가지고 있고 플라보노이드는 항산화 효과가 대단히 커서, 효소적 또는 비효소적으로 지질 과산화를 효과적으로 억제한다고 보고되었다18). 전자공여능은 지질 과산화 반응의 연쇄반응에 관여하는 산화성 자유 라디칼에 전자를 제공하여 연쇄반응을 정지, 산화를 억제시킨다. 산화성 자유 라디칼은 인체내에서 지질, 단백질 등과 결합하여 각종 질병 및 노화를 일으키는 척도가 되므로 자유 라디칼을 제거할 수 있는 항산화제를 식물에서 찾으려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 폴리페놀, 페놀산, 플라보노이드 등 페놀성 화합물의 경우 전자공여능이 크고, 특히 식물의 플라보노이드는 항산화성이 강해 자유 라디칼 terminator 혹은 금속의 chelator로 작용한다는 보고가 있다21). DPPH법은 항산화물질의 전자 공여능으로 인해 방향족 화합물 및 방향족 아민류에 환원되어 생긴 자색이 탈색되는 정도를 나타내는 지표로 항산화능을 나타내는 척도가 된다고 알려져 있다. 쑥의 에탄올추출물을 최종농도가 g/㎖로 되게 DMSO로 녹여 전자공여능을 측정한 결과 사자발쑥 19.0%, 황해쑥 24.4%로 나타나 상대적으로 황해쑥의 항산화능력이 높았다 (Fig. 4).   3. 휘발성 향기성분 분석 건조된 사자발쑥과 황해쑥의 추출된 휘발성 성분의 조성을 분석한 chromatogram을 Fig. 5에, 분리된 피크를 GC retention time과 GC/MS로 분석한 결과를 Table 1에 나타내었다. GC/MC로 분석한 사자발쑥의 주요성분 함량은 δ-3-carene, nerolidol, elemol, tetradecane, tetradecanol 순으로, 황해쑥은 eugenol, ethyl pentadecanoate, elemol, nonanoate 순으로 확인되었다. 확인된 성분을 관능기별로 분류하여 보면 탄화수소류 3종, 테르펜류 10종, 알데히드류 5종, 알코올류 8종, 에스테르류 5종등 총 31개 성분을 확인하였다. 탄화수소류에서 사자발쑥은 tetradecane이 가장 많았으며 황해쑥은 상대적으로 적었으며 테르펜류에서는 사자발쑥은 δ-3-carene이 높게 검출된 반면 황해쑥은 역시 적었다. 알데히드류에서 사자발쑥과 황해쑥은 모두 tetradecanol이 높게 검출되었고 알코올류에서는 사자발쑥은 nerolidol, elemol이 황해쑥은 eugenol, nerolidol이 높게 검출되었다. 에스테르류에서는 사자발쑥은 nonanoate, octanoate가 황해쑥은 ethyl pentadecanoate, nonanoate가 높게 검출되었다. 테르펜류중 pinene, camphene, limonene 등 탄소수 10개인 모노테르펜류는 부드럽고 나무, 소나무, 과일향 특성을 가진 반면에 caryphyllene, cubebene, farnesene 등 탄소수 15개인 세스퀴테르펜류는 모노테르펜보다 향이 약한 것으로 알려졌다22). 알코올과 에테르기를 갖는 oxygenated 테르펜은은 herb, spicy, citrus 특성의 식물 향에 영향을 미친다고 보고되었다23). 세스퀴테르펜은 살균, 제초, 살충제에 이용되며 쑥의 주요 휘발성 향기성분중 caryophyllene은 항돌연변이효과가 있고 eugenol은 세균생육을 억제하는 항균성물질로 보고되었다24). 쑥의 향기성분과 허브인 sage와 rosemary를 혼합하였을 때 항균력이 증가되며 caryophyllene과 indole 또는 caryophyllene과 farnesol을 혼합하였을 때 항균력이 높아진다고 보고되었다25). 이상과 같은 결과들을 종합해보면 사자발쑥의 주요향기성분은 테르펜류의 δ-3-carene과 알코올류의 nerolidol로, 황해쑥은 알코올류의 eugenol과 에스테르류의 ethyl pentadecanoate로 확인되었다.   >요약   CCl4에 의한 실험동물의 간 손상에 미치는 사자발쑥 (Artemisia princeps)과 황해쑥 (A. argyi)의 영향을 알아보고자 쑥 분말을 투여한 실험동물 혈청의 간기능지표 효소인 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), 그리고 alkaline phosphatase (ALP) 활성을 측정하였다. CCl4 단독투여군에 비해 CCl4와 사자발쑥 혼합병행군은 AST, ALT 및 ALP 활성을 각각 33, 23 및 19% 감소시켰고 CCl4와 황해쑥 혼합병행군 역시 각각 37, 33 및 26% 감소시켰다. 사자발쑥과 황해쑥을 에탄올로 추출하여 제조한 쑥추출물에 대한 항산화 성분을 측정한 결과, 총 페놀함량은 사자발쑥 10.2 ㎎/㎖, 황해쑥 4.7 ㎎/㎖로 나타나 사자발쑥의 함량이 보다 많았으며 플라보노이드함량은 사자발쑥 6.1 ㎎%, 황해쑥 3.6 ㎎%로 나타나 역시 사자발쑥의 함량이 보다 많았다. DPPH법에 의한 전자공여능 측정 실험에서 사자발쑥 19.0%, 황해쑥 24.4%로 나타나 황해쑥의 항산화 능력이 다소 높았다. 사자발쑥과 황해쑥의 추출된 휘발성 성분의 조성을 GC/MS로 분석한 결과, 사자발쑥의 주요향기성분은 테르펜류의 δ-3-carene (2.2%)과 알코올류의 nerolidol (0.9%)로, 황해쑥은 알코올류의 eugenol (1.4%)과 에스테르류의 ethyl pentadecanoate (1.1%)로 확인되었다.   >참고문헌   1. Yoshikawa, M, Shimada, H, Matsuda, H, Yamahara, J and Murakami, N. Bioactive constituents of Chinese natural medicine 1. Chem. Pharm. Bull. 44:1656-1662. 1996 2. Lee, SJ. Studies on the identification of Korean traditional folk medicine(1). Korean J. Raw Med. 6:75. 1975 3. Duke, JA. Handbook of Medicinal Herbs. CRC Press, Boca Raton, FL, USA. pp.69-70. 1985 4. Tanaka, T. Tanaka's Cyclopedia of Edible Plants of the World. Keigaku Pub. 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